Weg vom FBS - Humanes Plättchenlysat in der Zellkultur

Seit längerem ist bekannt, dass humanes Plättchenlysat (= humanes Thrombozytenlysat; engl. human Platelet Lysate; hPL) eine echte Alternative zu dem in der Zellkultur exzessiv genutzten, aber mindestens ebenso umstrittenen, fötalen Kälberserum (FBS) darstellt. Tatsächlich weiß man mittlerweile, dass die Faktoren, die FBS zu einem so hervorragenden Medienzusatz und Serumersatz machen aus aktivierten Rinderthrombozyten stammen und beim Herstellungsprozess in das Serum gelangen. Der Ansatz, direkt auf den Thrombozyten-Inhalt zuzugreifen ist also naheliegend.

Humanes Plättchenlysat erhält man, wenn man die Zellstruktur humaner Thrombozyten aufbricht (die Zellen „lysiert“) und dann alles, was im Zellinneren gelöst ist, durch Zentrifugation von den festen Zellbestandteilen separiert. Beim Plättchenlysat handelt es sich also um ein buntes Molekülgemisch aus dem Thrombozyten-Inneren.
In den letzten Jahren wurden Plättchenlysate schon erfolgreich für verschiedene humane und tierische Zellen und Zelllinien eingesetzt – und konnten vergleichbare bzw. verbesserte Wachstumsergebnisse erzielen.

Wir sind überzeugt davon, dass die Verwendung von FBS in den nächsten Jahren immer stärker hinterfragt werden wird und sich neben definierten, synthetischen Medienrezepturen auch xeno-freie Serum-Alternativen wie das hPL langfristig durchsetzen werden!

Der Wunsch, Nachhaltigkeit und Tierwohl in allen Bereichen unseres Lebens zu fordern und zu fördern, sollte gerade in der naturwissenschaftlichen und medizinischen Forschung nicht verloren gehen. Die Zeit ist reif für einen Wandel in der Kultivierung humaner Zellen; weg von tierischen und unter fragwürdigen Bedingungen gewonnenen Bestandteilen und hin zu xeno-freien Alternativen.

Fötales Rinderserum stammt, wie der Name schon sagt, aus ungeborenen Kälbchen. Es handelt sich um ein lukratives Nebenprodukt der Fleischindustrie. In den meisten europäischen Ländern ist die Gewinnung von FBS zu kommerziellen Zwecken untersagt und aufgrund der meist gängigen Stallhaltung werden auch nur selten unbemerkt trächtige Tiere zur Schlachtbank geführt. In den Hauptursprungsländern für FBS (Brasilien, Neuseeland, USA) werden die Rinder dagegen in großen Herden gehalten, sodass ein beträchtlicher Anteil der weiblichen Tiere (ca. 8%) trächtig in die Schlachtung gehen. Wenn während des Schlachtprozesses bemerkt wird, dass die Kuh trächtig ist, wird der Fötus aus dem Mutterleib herausgeschnitten und in einen separaten Raum gebracht. Unter aseptischen Bedingungen – soweit möglich – wird das Herz des Fötus freigelegt, mit einer breiten Kanüle punktiert und das Blut bei noch schlagendem Herz entnommen. Da die Blutmenge der Föten noch recht gering ist, ist diese grausame Prozedur das Mittel der Wahl, um möglichst viel des kostbaren Rohstoffs zu erhalten.

Sicherlich, die Föten wären so oder so gestorben, die Frage ist aber, ob man das Leid und die Schmerzen der Tiere so hinnehmen darf.

Der weltweite Bedarf an FBS liegt Schätzungen zufolge übrigens bei etwa 800.000 L pro Jahr. Und für einen Liter FBS braucht es im Schnitt 3-4 Rinderföten!

Wie wird hPL hergestellt?

Als Ausgangsstoff für hPL dienen abgelaufene humane Thrombozytenkonzentrate, die von Blutspendediensten hergestellt werden und für Thrombozyten-Spenden vorgesehen sind. Für Transfusionszwecke dürfen die Thrombozytenkonzentrate nur wenige Tage alt sein. Ist ein Zeitraum von 5 Tagen überschritten, müssen sie entsorgt werden. Schätzungen zufolge kommen 5-20 % der Thrombozytenkonzentrate nicht zum Einsatz. Diese Thrombozytenkonzentrate können für die Herstellung von hPL verwendet und so als Serumersatz in der Zellkultur einer neuen Bestimmung zugeführt werden.

Dafür werden die abgelaufenen Thrombozytenkonzentrate zu größeren Volumina „gepooled“, durch Gefrier- und Auftau-Prozesse lysiert und die Zelltrümmer sowie festen Aggregate durch Zentrifugation entfernt.

Vollblut wird in der Regel zu drei verschiedenen Arten von Blutpräparaten weiterverarbeitet: Erythrozytenkonzentrate, Frischplasmapräparate und Thrombozytenkonzentrate.

Das Blut wird mit einem Gerinnungshemmer versetzt und durch Zentrifugation in die einzelnen Fraktionen aufgetrennt. Die Erythrozyten (rote Blutkörperchen, ca. 45 % der Blutmenge) befinden sich nach dem Zentrifugieren in der untersten Schicht, während das zellfreie Blutplasma (ca. 55 %) als leichteste Komponente ganz oben schwimmt. Zwischen Erythrozyten und Plasma entsteht beim Zentrifugieren der sogenannten Buffy-Coat (engl. buff: lederfarben, coat: Schicht, Film); eine bräunliche Grenzschicht bestehend aus weißen Blutzellen (Leukozyten) und Blutplättchen (Thrombozyten). Der Buffy Coat wird für die weitere Verwendung von weißen Blutkörperchen befreit, um daraus (Leukozyten-depletierte) Thrombozytenkonzentrate herzustellen.

Was genau ist drin?

Humanes Plättchenlysat ist ein komplexes Gemisch aus Proteinen, niedermolekularen Stoffen, Vitaminen, Mineralien und Elektrolyten. Neben dem Thrombozyteninhalt sind auch Bestandteile des Blutplasmas (Plasmaproteine, verschiedene Proteaseinhibitoren und Carrier sowie Fibrinogen) enthalten, da die Thrombozyten gängigerweise in Plasma gelagert werden.

Worauf es aber beim Serumersatz mit hPL besonders ankommt: Thrombozyten beherbergen eine Vielzahl potenter mitogener Wachstumsfaktoren und Cytokine wie EGF, bFGF, IGF-1, HGF, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, TGF-β1, BDNF und VEGF.

Wenn schon kein FBS, warum dann nicht gleich synthetische Medien? Serumfreie, xeno-freie, chemisch definierte Medien haben leider ein paar entscheidende Nachteile, durch die sie sich für einige Zellen und Zelllinien als suboptimal herausstellen. Zunächst braucht praktisch jeder Zelltyp sein spezielles Medium, dass auf die spezifischen Ansprüche der Zellen optimal ausgerichtet ist.  Solch ein Medium zu finden oder zu entwickeln dauert.

Außerdem unterstützen die bisher verfügbaren synthetischen Medien in der Regel nicht die initialen Isolations- und Expansionsschritte von adhärenten Zellen – es sei denn man weicht auf speziell beschichtete Zellkulturgefäße aus. Und die Beschichtung, die die Oberfläche so attraktiv für die Zellanheftung macht, besteht dann meist wieder aus tierischen Peptiden und Serumproteinen. Also auch nix mit definierten und Xeno-freien Bedingungen.

Für welche Zellen ist hPL besonders geeignet?

Generell kann man sagen, dass hPL für die in-vitro Kultivierung von fast allen humanen und tierischen Zellen geeignet ist.

Thrombozytenlysate werden bereits erfolgreich in der Vermehrung und Erhaltung verschiedenster adhärenter Zellen und Zellen in Suspension eingesetzt. Besonders gut untersucht ist die herausragende Performance in Zusammenhang mit humanen Mesenchymalen Stammzellen (MSCs).  Andere humane Zellen, wie Endothelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten und verschiedene Krebszelllinien wachsen mit hPL ebenfalls sehr gut. Auch für tierische Zellen gibt es mittlerweile viele Beispiele, die die Eignung von hPL als FBS-Ersatz belegen.

  • Adipose-derived Stem Cells (ADSC)
  • Chondrocytes
  • Corneal Keratocytes
  • Dental Follicular Cells (DFSC)
  • Dental Pulp Stem Cells (DPSC)
  • Fibroblasts (Dermal Fibroblasts, Foreskin Fibroblasts)
  • Gamma-Delta-T-Cells
  • Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC)
  • Hematopoietic Stem Cells (HSC)
  • Lymphocytes from Blood
  • Macrophages/Monocytes
  • Mesenchymal Stem Cells from Adipose Tissue (MSC-AT), Bone Marrow (MSC-BM), Mononuclear Cells (MSC-MNC) and Umbilical Cord (MSC-UC)
  • Mesenchymal Stem Cells differentiated from iPSCs
  • Neural Crest Cells
  • Periodontal Ligaments Cells (PDL)
  • Stem Cells from Sweat Glands (SGSC)
  • Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)
  • Bone Osteosarcoma Cell Lines (HOS(TE85), U-2 OS)
  • Breast Cancer Cell Lines (MCF-7, BT-20, HBL100)
  • Cervical Cancer Cell Line (HeLa)
  • Chordoma cell lines
  • Colon Adenocarcinoma Cell Line (LS 180)
  • Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (HROC24)
  • Dermal Keratinocytes (NCTC 2544, HaCaT)
  • Embryonal Lung Fibroblasts (MRC-5)
  • Embryonic Kidney Cell Line (HEK-293)
  • Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2)
  • Epithelial Mammary Gland; Breast/Duct (ZR-75-1)
  • Fetal Foreskin Fibroblasts (HFFF2)
  • Gastric Carcinoma Cell Line (HGC-27)
  • Gingival Fibroblasts (HGF-1)
  • Glioblastoma Multiforme Cell Line (U-251 MG)
  • Hematopoietic Stem Cells (HSC)
  • Human Epithelial Cell Line Type 2 (HEp-2)
  • Leukemia Cell Lines (THP-1, HL-60, Jurkat, KG-1, Kasumi-1, K562)
  • Lung Adenocarcinoma Cell Line (A-549)
  • Lung Large Cell Carcinoma (LCC)
  • Lymphocytes (immortalized)
  • Melanoma Cell Line
  • MSCs containing catalytic subunit of telomerase (hMSC-TERT)
  • Pancreas Adenocarcinoma Cell Line (Panc-1)
  • Retinal Pigmented Epithelium (ARPE-19)
  • Renal Clear Cell Carcinoma Cell Line (RCC-ER)
  • Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)
  • Urinary Bladder Carcinoma Cell Line (5637)
  • Bovine Corneal Endothelial Cells (CEC)
  • Murine Astrocytes
  • Murine Mesenchymal Stem Cells
  • Murine Microglia
  • Rat Mesenchymal Stem Cells
  • Sprague-Dawley Rat Spiral Ganglions (SGC)
  • African Green Monkey Fibroblast (COS-7)
  • African Green Monkey Kidney (Vero)
  • Chinese Hamster Ovary Epithelial (CHO)
  • Mouse Adenocarcinoma (RAG)
  • Mouse Fibroblast (L929)
  • Mouse Mammary Tumor (MMT 060562)
  • Mouse Microglia (BV-2)
  • Mouse Myeloma (Sp2O-Ag14)
  • Mouse Neuroblastoma (Neuro-2a)
  • Rabbit Cornea, Statens Seruminstitut (SIRC)
  • Rat Adrenal gland (PC-12)
  • Rat Testis (R2C)

Sollte Deine Zelllinie in unserer Aufzählung nicht mit dabei sein, liegt es (auch) an Dir herauszufinden, ob die Zellen mit denen Du arbeitest, für die Kultivierung mit hPL geeignet sind. Und optimalerweise auch gleich, in welcher Konzentration das hPL seine beste Wirkung entfaltet.

Wir bei neoFroxx freuen uns auf Deine Rückmeldung und werden Deine Erfahrungen gerne mit anderen Anwender*innen teilen. Je mehr Feedback wir bekommen, desto besser. Für Dich, für andere Zellkultur-Anwender*innen und vor allem für den gemeinsamen Ausstieg aus dem FBS-Gebrauch.

Falls du Diese Informationen als pdf bevozugst, kannst Du die hPL-Zelllinienübersicht hier downloaden.

Vorteile gegenüber FBS

Humanes Plättchenlysat ist ebenso wie fötales Kälberserum ein nur vage definierter Medienzusatz. Aber hPL besitzt gegenüber FBS einige entscheidende Vorteile:

  • Verursacht kein unnötiges Tierleid
  • Sehr hohe Qualität durch hochwertiges und umfassend getestetes Ausgangsmaterial
  • Größere Sicherheit; keine Übertragung tierischer Krankheitserreger; Negativtestung auf verschiedenste Viren
  • Hohe Chargenstabilität bei ausreichender Poolgröße (>50 Spender) und damit Wegfall der zeitintensiven Chargentestung
  • Bessere Reproduzierbarkeit
  • Bessere Performance; hPL ermöglicht schnelleres Wachstum bei geringerem Verbrauch: Konzentration im Medium beträgt oft nur 2-5 %
  • Xeno-frei; erste Wahl für die in-vitro Kultivierung humaner Zellen
  • Herstellung nach GMP möglich; geeignet für klinische Studien und klinische Anwendungen in der Zelltherapie
  • Gute Verfügbarkeit und stabiler Preis
  • Nachhaltig

Wie beim FBS handelt es sich auch beim hPL streng genommen um ein weiter prozessiertes Abfallprodukt. Allerdings mit dem großen Unterschied, dass es sich bei dem „Rohstoff“ für das hPL um ein hochwertiges medizinisches Produkt handelt, nicht um ein Beiprodukt der Massenschlachtung – und dass für die Gewinnung kein unnötiges Tierleid in Kauf genommen wird. Es sprechen also sowohl qualitative, als auch ethische Gründe für einen Serumersatz durch hPL.

Nachteile?

Augen auf beim Lysat-Kauf! Die teilweise unterschiedlichen Ausgangsmaterialien sowie die von Hersteller zu Hersteller variierende Prozessierung der Thrombozyten führen zu deutlichen Unterschieden in der Qualität des finalen Produkts.  hPL ist nicht gleich hPL. Für wichtige Kriterien wie die Poolgröße, Fibrinogen-Gehalt und anschließende Testung auf Zellkultur-relevante Parameter wie Mykoplasmen und Endotoxine gibt es keinen herstellerübergreifenden Qualitätsstandard.

  • Fibrinogengehalt. Da humane Thrombozyten-konzentrate in der Regel in Blutplasma gelagert werden, enthält das Plättchenlysat Gerinnungsfaktoren (Fibrinogen). Diese können zwar in einem weiteren Prozessierungsschritt aus dem hPL entfernt werden, häufig werden aber humane Plättchenlysate angeboten, in denen das Fibrinogen enthalten ist. Bei diesen Produkten ist die Zugabe von Antikoagulantien wie Heparin erforderlich, um eine Gelatinierung des Mediums zu verhindern.  Wird dafür das kostengünstige Schweineheparin verwendet ist das fertige Kulturmedium natürlich alles andere als xeno-frei.
    Synthetische Heparine sind verfügbar, aber teuer. Zudem ist bekannt, dass Heparin in höheren Konzentrationen eine negative Wirkung (z. B. reduzierte Proliferation, beeinträchtigte Differenzierung und Zellmigration, geringere Viabilität) auf humane Zellen hat.
    Empfehlenswerter sind daher ganz klar die Fibrinogen-abgereicherten (Fibrinogen-depleted, kurz FD) hPL-Produkte, die ohne Heparin-Zusatz auskommen und „ready-to-use“ sind. Je nach Abreicherungsmethode kann FD-hPL Spuren von Heparin enthalten, die dann aber bei den als „xeno-frei“ deklarierten Produkten synthetischen Ursprungs sein sollten.
  • Poolgröße. Wird das hPL aus einem zu geringen Spenderpool (<50) generiert, muss mit Chargenschwankungen gerechnet werden.
  • Immunoglobuline. Der Immunoglobulingehalt in hPL ist höher als in FBS.
Fibrinogen-abgereichertes humanes Plättchenlysat für die Zellkultur

hPL von neoFroxx

  • Erhältlich in „Fibrinogen-depleted“, ready-to-use ohne Heparin-Zugabe
  • 100 % Xeno-frei
  • Chargenkontinuität durch Pools von 150 bis 300 gesunden Spendern
  • Hergestellt in FDA-lizenzierten Blutspende-zentren: Negative Tests auf Hepatitis B, HIV, Hepatitis C, Humane T-lymphotrope Virus 1 und 2, Trypanosoma cruzi, West-Nil-Virus, Syphilis und Zika-Virus
  • Hervorragende Performance durch optimierten Herstellungsprozess
  • Erhältlich in GMP grade: Hergestellt, geprüft und freigegeben unter Beachtung der GMP-Richtlinien; DMF verfügbar
  • Getestet auf Mykoplasmen, Endotoxine, Sterilität und MSC-Performance
BezeichnungHeparin-Zugabe erforderlich?AnwendungsbereichUrsprungArtikelnummerDownloads
Humanes Plättchenlysat für die Zellbiologie, Fibrinogen-depleted & Gamma-irradiated, GMP gradeneinHergestellt nach GMP; für klinische Studien und Zelltherapie-AnwendungenUS2322TDA
Spezifikation
Humanes Plättchenlysat für die Zellbiologie, Fibrinogen-depleted, GMP gradeneinHergestellt nach GMP; für klinische Studien und Zelltherapie-AnwendungenUS2320TDA
Spezifikation
Humanes Plättchenlysat Premiumqualität für die Zellbiologie, Fibrinogen-depletedneinForschungsanwendungen / prä-klinische StudienUS2319TDA
Spezifikation
Humanes Plättchenlysat Premiumqualität für die ZellbiologiejaForschungEU2304TDA
Spezifikation
Humanes Plättchenlysat Standardqualität für die ZellbiologiejaForschungEU2298TDA
Spezifikation

Was muss ich bei der Umstellung von FBS auf hPL beachten?

Wenn Du Dich für den Serumersatz durch hPL entscheidest, empfehlen wir Dir zu Beginn des Wechsels zunächst verschiedene hPL-Konzentrationen auszuprobieren, um die optimale Konzentration für den jeweiligen Zelltyp und die jeweilige Anforderung zu finden.

Typische Konzentrationen liegen im Bereich von 1-10% und in diesem Fall gilt: Mehr ist nicht gleich besser! Steht die Konzentration einmal fest, sind keine weiteren Testungen (Chargentestungen) mehr nötig.

Das Thema interessiert dich und du möchtest gerne mehr erfahren? Wir empfehlen Dir folgende Artikel:

  • Lindl & G. Gstraunthaler, Fetales oder fatales Kälberserum? Das Schmuddelkind der Zellkultur, Laborjournal 7-8/2019
  • Rauch et al., Alternatives to the Use of Fetal Bovine Serum: Human Platelet Lysates as a Serum Substitute in Cell Culture Media, ALTEX 28, 4 /2011
  • van der Valk et al., Fetal Bovine Serum (FBS): Past – Present – Future, ALTEX 35(1), 2018
  • Gstraunthaler & T. Lindl, Auf der Suche nach brauchbaren Serumalternativen, BIOspektrum 06/2017
  • Fernandez-Rebollo et al., Human Platelet Lysate versus Fetal Calf Serum: These Supplements Do Not Select for Different Mesenchymal Stromal Cells, Scientific Reports 11/2017
  • Bieback et al., Gaps in the knowledge of human platelet lysate as a cell culture supplement for cell therapy: a joint publication from the AABB and the International Society for Cell & Gene Therapy, TRANSFUSION Vol. 59, 2019
  • Burnouf et al., Human platelet lysate: Replacing fetal bovine serum as a gold standard for human cell propagation? Biomaterials 76, 2016